关于WB实验中常见问题的五个建议(收藏版)
作者:admin | 来源:百度 | 发布时间:2019-01-28 23:37 | 浏览次数:

Westernblot(Western blot)包含许多知识作为科学研究的一种方法。在一个小实验中有一篇很棒的文章。
针对世界银行实验中常见的一些问题,上海生物技术委员会恒源总结了五个提案“我认为你喜欢它”。
更好地理解实验的五个要点:1。
对裂解物的阳性对照用于显示实验室是有效且正确的并且目标蛋白质未在样品中表达。
2
样品旁边的分子量标准测量蛋白质的分子量并控制电泳的进程。
3
请勿直接触摸膜。请用镊子。手指中的油和蛋白质会妨碍转移效率并导致背景污染。
4
确保切割薄膜和滤纸与凝胶尺寸相同,并且在薄膜转移过程中边缘太大而无法通过薄膜边缘。

由于无法确定蛋白质的相对量,因此暴露的过膜不适合分析。
建议五个背景点的更好解决方案:1。
将抗体稀释至适当浓度,并用较高稀释度的抗体长时间孵育。
2
抗体的孵育温度过高:在4°C孵育。
3
膜干燥:确保反应溶液充足,避免干膜。
4
关闭不足:考虑延长关闭时间并更换适当的密封剂(脱脂奶粉,BSA,乳清等)。

不合适的清洁未结合的蛋白质:增加洗涤频率。
关于更好地解决抗体问题的五点建议:1。
初级和二级抗体之间的关系更为重要。调整一抗与二抗的比例可以消除一些非特异性背景。
2
我们进行细胞信号传导并磷酸化Western Blot因子。对于二抗,根据所选择的实验条件,不必推荐HRP标记的二抗。
3
应该试验不同的抗体,包括来自同一公司的抗体,因为抗体稀释率不同。
4
使用在蛋白抗体,即,识别线性表位时,所述抗体可以在免疫组化两者和Western还原中使用的几个氨基酸,如果抗体识别构象表位只能使用。
识别抗体的氨基酸范围显示在常见抗体的说明书中。
(仅限于单克隆抗体)
使用抗体的工作溶液通常不要求存储以供重复使用,但如果抗体更有价值,则可以使用2至3次。
应在稀释后2至3天内使用,并应储存在4度以避免反复冻融。
没有信号的5点提案的更好解决方案:1。
第二抗体必须与第一抗体宿主相同(例如,第一抗体是兔,第二抗体是抗兔抗体)。
原因:一抗和二抗不匹配。
2
请参阅设置阳性对照的说明。
原因:一抗不识别测试物种的蛋白质。
3
每个泳道的蛋白质负荷超过20-30g,建立阳性对照。
原因:抗原量不足。
4
使用可变光点(如Ponceau S)检测转印膜的效果并检查转印操作是否正确。
预先将PVDF膜浸入甲醇中。
原因:电影还不够。

使用0
5%缩短完成脱脂奶粉或密封胶更换的时间。
原因:过度闭合会阻止目标蛋白的颜色发展。
五点可以更好地解决多频段现象:1。
请查看文献。
原因:体内表达的蛋白质具有各种修饰,例如乙酰化,甲基化,糖基化等。
2
向样品缓冲液中加入足量的蛋白酶抑制剂。
原因:蛋白质样品降解(蛋白质分子量降低)。
3
降低抗体浓度或抗体孵育时间。原因:一抗浓度过高,多种蛋白质条带通常以高浓度出现。
4
使用原始的未转导细胞系以及当前细胞系进行平行对照实验。
原因:由于细胞传代过多,蛋白质表达不同。

降低抗体浓度并增加二抗(无一抗)的控制。
原因:二抗的浓度太高,并且在高浓度下它变成非特异性组合。解决其他问题的五点建议更好:1。
当转移膜时,或当抗体不均匀地分布在膜中时,膜中存在气泡。
2
背景上有黑点。抗体与封闭剂(过滤封闭剂)结合。
3
微笑条带:移动速度太快,或电泳温度太高,pH值和运动速度变化(冷迁移或电泳速度较低)。
4
抗体量不足:确保在孵育过程中抗体完全浸没在膜中。

目标条带太低/太高:分离不完整。
为了适应市场的需求和长远发展,上海恒源生物是引进国外的有关技术专家和先进的技术在近几年的消化,并不断完善和更新产品和技术,在同一时间,以提高质量,本公司,标准的一般管理水平的改善和系统保证专业,高效是我们的技术服务要求之一,科研和实验产品的专业供应商之一是的。我希望能够实现质量,承诺,进步,满足每位老师的实验要求,为双方提供更好的条件。发展!

相关文章: